ELISA komplektide testimise nõuded

Tehke formaalses testis hea kontrast, tuleks võtta positiivse ja negatiivse kontrolli testitingimused ning testitavatest proovidest tuleb teha kahes eksemplaris, et tagada testitulemuste täpsus.

Mõnikord on taust kõrgem, mis viitab mittespetsiifilisele reaktsioonile, võib olla suletud lamba seerumi, küüliku seerumi või BSA abil.

Katsetingimuste valik

ELISA-s on oluline valida erinevad katsetingimused, sealhulgas: (1) Tahkefaasi{1}}kandjate valik: tahke faasi kandjatena saab kasutada paljusid aineid, nagu PVC, polüstüreen, polüakrüülamiid ja tselluloos. See võib olla nõgusa plaadi, katseklaasi, helme jne kujul. Praegu kasutatakse seda tavaliselt 40 süvendiga nõgusate polüstüreenplaatide jaoks.

Sõltumata sellest, millist kandjat saab enne kasutamist sõeluda: sama koguse antigeeni pakendiga on samades katsetingimustes reageerida, et jälgida, kas selle värviedastusreaktsioon on homogeensus, mille järgi on see hea adsorptsioonivõime. (2) Pakend antikeha (või antigeeni) valiku järgi: tahke faasi kandja pinnale adsorbeeritud antikeha (või antigeen), nõude raskusaste on parem, adsorptsiooniks on tavaliselt vaja pH vahemikus 9,0 kuni 9,6. Adsorptsioonitemperatuuril, -ajal ja valgukogusel on samuti teatud mõju, tavaliselt üle 4 kraadi C 18-24 tunni jooksul. Valgupakkide optimaalne kontsentratsioon tuleb tiitrida: pärast erinevate valgukontsentratsioonidega (0,1, 1,0 ja 10 µg/ml jne) pakkimist jälgitakse positiivsete proovide OD väärtusi, kui muud katsetingimused on samad. Valige suurima OD väärtusega kontsentratsioon ja väikseima valgukogusega.

Enamiku valkude puhul on see tavaliselt 1 kuni 10 ug/ml. (3) Ensüümiga -märgistatud antikeha töökontsentratsiooni valimine: esiteks otsese ELISA meetodi abil tiitrimise esialgne efekt (vt ensüümi -märgistatud antikeha osa).

Seejärel määrake muud tingimused või kasutage "ruutmassiivi meetodit" (pakkimine, uuritava proovi võrdlus ja ensüümi -märgistatud antikehad on erinevad lahjendused) ametlikus katsesüsteemis, tiitrides selle töökontsentratsiooni täpselt. (4) Ensüümi aluse ja vesinikudoonori valik: vesiniku doonori valik on odav, ohutu, selge värviedastusreaktsiooniga ja ise on värvitu. Mõnel vesiniku doonoril (nt OPD jne) on võimalik kantserogeenne toime, mille eest tuleb hoolitseda. Tingimuslikud inimesed peaksid kasutama mitte-kantserogeenseid, kõrge tundlikkusega vesinikdoonoreid, nagu TMB ja ABTS on praegu rahuldavamad vesiniku doonorid. Pärast teatud toimimisperioodi tuleb reaktsiooni peatamiseks lisada tugevaid happeid või leeliseid. Tavaliselt on sobiv substraadi toimeaeg 10-30 minutit. Aluspinna kasutusvedelik tuleb valmistada värskelt, eriti kui H2O2 on lisatud enne kasutamist.